中華人民共和國國家標準GB/T 16294―2010代替GB/T 16294―1996

潔凈室（區）沉降菌技術要求與測試方法

Test method for settling microbe in clean room (zone) of the pharmaceutical industry

前 言

本標準參考了ISO 14698-1《潔凈間以及相關環境控制第1部分：微生物控制》，ISO/TS 11133-1：2000（英文版）《食品和動物飼料的微生物學培養基制備和生產指南第1部分：實驗室培養基制備的質量保證通用指南》。

本標準代替GB/T 16294-1996《醫藥工業潔凈室（區）沉降菌的測試方法》。

本標準與GB/T 16294-1996的主要區別為：

―增加了確定最少采樣點數目的方法；

―修改了原標準4.8.3.2，改為“4.10.2采用大豆酪蛋白瓊脂培養基（TSA）配制的培養皿經采樣后，在30℃~35℃培養箱中培養，時間不少于2d，采用沙氏培養基（SDA）配制的培養皿經采樣后，在20℃~25℃培養箱中培養，時間不少于5d。”；

―本標準增加了5.8“日常監控”的內容，增加了潔凈室（區）空氣微生物濃度控制的糾偏限度和警戒限度的設立和如何確定取樣頻次的內容。

本標準的附錄A、附錄B是規范性附錄。

本標準的附錄C是資料性附錄。

本標準由國家食品藥品監督管理局提出并歸口。

本標準起草單位：上海市食品藥品包裝材料測試所、中國食品藥品檢定研究院醫療器械檢驗中心。

本標準主要起草人：陸維怡、徐敏鳳、馮曉明、王志敏。

本標準所代替標準的歷次標本發布情況為：GB/T 16294-1996。

潔凈室（區）沉降菌技術要求與測試方法

1 范 圍

 

本標準規定了醫藥工業潔凈室和潔凈區中沉降菌測試條件、測試方法。

本標準適用于醫藥工業潔凈室和潔凈區，無菌室或局部空氣凈化區域（包括潔凈工作臺）的沉降菌的測試和環境的驗證。

2 規范性引用文件

 

下列文件中的條款通過本標準的引用而成為本標準的條款。凡是注日期的引用文件，其隨后所有的修改單（不包括勘誤的內容）或修訂版均不適用于本標準，然而，鼓勵根據本標準達成協議的各方研究是否可使用這些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本適用于本標準。

GB/T 16292-2010醫藥工業潔凈室（區）懸浮粒子的測試方法

3 術語和定義

 

下列術語和定義適用于本標準。

3.1沉降菌settling microbe

用本標準提及的方法收集空氣中的活微生物粒子，通過專門的培養基，在適宜的生長條件下繁殖到可見的菌落數。

3.2沉降菌菌落數settling microbe plate count

規定時間內每個平板培養皿收集到空氣中沉降菌的數目，以個/皿表示。

4 測試方法

 

4.1方法提要

本測試方法采用沉降法，即通過自然沉降原理收集在空氣中的生物粒子于培養基平皿，經若干時間，在適宜的條件下讓其繁殖到可見的菌落進行計數，以平板培養皿中的菌落數來判定潔凈環境內的活微生物數，并以此來評定潔凈室（區）的潔凈度。

4.2人員的職責及培訓

潔凈室（區）的測試人員應進行本專業的培訓并獲得相應資格后才能履行對潔凈室（區）測試的職責，其中包含涉及的衛生知識和基本微生物知識。

潔凈室（區）的測試人員應選與生產操作的空氣潔凈度級別要求相適應的穿戴方式，外面的衣服不能帶進100000級以上的區域。

4.3儀器

儀器應包括：

a）培養皿；

b）培養基（見本標準附錄B）；

c）恒溫培養箱；

d）高壓蒸汽滅菌器。

4.3.1培養皿

一般采用φ90mm×15mm規格的培養皿。

4.3.2培養基

大豆酪蛋白瓊脂培養基（TSA）或沙氏培養基（SDA）或其他用戶認可并經驗證了的培養基。其配制方法見附錄B。

4.3.3恒溫培養箱

必須定期對恒溫培養箱進行校驗。

4.4測試步驟

4.4.1測試前培養基表面必須嚴格消毒。

4.4.2將已制備好的培養皿按采樣點布置圖逐個放置，然后從里到外逐個打開培養皿蓋，使培養基表面暴露在空氣中。

4.4.3靜態測試時，培養皿暴露時間為30min以上；動態測試時，培養皿暴露時間為不大于4h。

4.4.4全部采樣結束后，將培養皿倒置于恒溫培養箱中培養。

4.4.5采用大豆酪蛋白瓊脂培養基（TSA）配制的培養皿經采樣后，在30℃~35℃培養箱中培養，時間不少于2d；采用沙氏培養基（SDA）配制的培養基經采樣后，在20℃~25℃培養箱中培養，時間不少于5d。

4.4.6每批培養基應有對照試驗，檢驗培養基本身是否污染。可每批選定3只培養皿作對照培養。

4.5菌落計數

4.5.1用肉眼對培養皿上所有的菌落直接計數、標記或在菌落計數器上點計，然后用5~10倍放大鏡檢查，有否遺漏。

4.5.2若平板上有2個或2個以上的菌落重疊，可分辨時仍以2個或2個以上菌落計數。

4.6注意事項

4.6.1測試用具要作滅菌處理，以確保測試的可靠性、正確性。

4.6.2采取一切措施防止人為對樣本的污染。

4.6.3對培養基、培養條件及其他參數作詳細的記錄。

4.6.4由于細菌種類繁多，差別甚大，計數時一般用透射光于培養皿背面或正面仔細觀察，不要漏計培養皿邊緣生長的菌落，并須注意細菌菌落與培養基沉淀物的區別，必要時用顯微鏡鑒別。

4.6.5采樣前應仔細檢查每個培養皿的質量，如發現變質、破損或污染的應剔除。

5 測試規則

 

5.1測試條件

在測試之前，要對潔凈室（區）相關參數進行預先測試，這類測試將會提供測試沉降菌的環境條件，例如：這種預先測試或可包括：

a）溫度和相對濕度的測試。潔凈室（區）的溫度和相對濕度應與其生產及工藝要求相適應（無特殊要求時，溫度在18℃~26℃，相對濕度在45%~65%為宜）。同時應滿足測試儀器的使用范圍；

b）室內送風量或風速的測試，或壓差的測試；

c）高效過濾器的泄漏測試。

5.2測試狀態

靜態和動態兩種狀態均可進行測試。

靜態測試時，室內測試人員不得多于2人。

沉降菌測試前，被測潔凈室（區）由使用者決定是否需要預先消毒。

測試報告中應標明測試時所采用的狀態和室內測試人員數。

5.3測試時間

5.3.1在空態或靜態a測試時，對單向流潔凈室（區）而言，測試宜在凈化空氣調節系統正常運行時間不少于10min后開始。對非單向流潔凈室（區），測試宜在凈化空氣調節系統正常運行時間不少于30min后開始。在靜態b測試時，對單向流潔凈室（區），測試宜在生產操作人員撤離現場并經過10min自凈后開始；對非單向流潔凈室（區），測試宜在生產操作人員撤離現場并經過20min自凈后開始。(原文鏈接：http://www.iwuchen.com/a-63/)

5.3.2在動態測試時，則須記錄生產開始的時間以及測試時間。

5.4沉降菌菌落數計算

5.4.1采樣點數量及其布置

5.4.1.1最少采樣點數目

沉降菌測試的最少采樣點數目可參照GB/T 16292-2010。

5.4.1.2采樣點的位置

沉降菌的采樣點位置可參照GB/T 16292-2010。

a）工作區采樣點位置離地0.8m~1.5m左右（略高于工作面）；

b）可在關鍵設備或關鍵工作活動范圍處增加測點。

采樣點布置的規則見附錄A。

5.4.2最少培養皿數

在滿足最少采樣點數目的同時，還宜滿足最少培養皿數，見表1。

表1最少培養皿數

5.4.3采樣次數

每個采樣點一般采樣一次。

5.4.4采樣注意事項

5.4.4.1對于單向流潔凈室（區）或送風口，采樣器采樣口朝向應正對氣流方向；對于非單向流潔凈室（區），采樣口向上。

5.4.4.2布置采樣點時，至少應盡量避開塵粒較集中的回風口。

5.4.4.3采樣時，測試人員應站在采樣口的下風側，并盡量少走動。

5.4.4.4應采取一切措施防止采樣過程的污染和其他可能對樣本的污染。

5.4.4.5培養皿在用于檢測時，為避免培養皿運輸或搬動過程造成的影響，宜同時進行對照試驗，每次或每個區域取1個對照皿，與采樣皿同法操作但不需暴露采樣，然后與采樣后的培養皿（TSA或SDA)一起放入培養箱內培養，結果應無菌落生長。

5.5記錄

測試報告應包含以下內容：

a）測試者的名稱和地址，測試日期；

b）測試依據；

c）被測潔凈室（區）的平面位置（必要時標注相鄰區域的平面位置）；

d）有關測試儀器及其測試方法的描述：包括測試環境條件，采樣點數目以及布置圖，測試次數，或可能存在的測試方法的變更，測試儀器的檢定證書等；若為動態測試，則還應記錄現場操作人員數量及位置，現場設備運轉數量及位置等；

e）測試結果；包括所有統計計算資料。

5.6結果計算

5.6.1用計數方法得出各個培養皿的菌落數。

5.6.2每個測點的沉降菌平均菌落數的計算，見式（1）。

5.7結果評定

5.7.1每個測點的沉降菌平均菌落數必須低于所選定評定標準中的界限。

5.7.2在靜態測試時，若某測點的沉降菌平均菌落數超過評定標準，則應重新采樣兩次，兩次測試結果均合格才能判為符合。

5.8日常監控

對于沉降菌的監控，宜設定糾偏限度和警戒限度，以保證潔凈室（區）的微生物濃度受到控制。應定期檢測以檢查微生物負荷以及消毒劑的效力，并作傾向分析。靜態和動態的監控都可以采用該方法。

對于沉降菌的取樣頻次，如果出現下列情況應考慮修改，在評估以下情況后，也應確定其他項目的檢測頻次：

―連續超過糾偏限度和警戒限度；

―停工時間比預計延長；

―關鍵區域內發現有污染存在；

―在生產期間，空氣凈化系統進行任何重大的維修；

―日常操作記錄反映出傾向性的數據；

―消毒規程的改變；

―引起生物污染的事故等；

―當生產設備有重大維修或增加設備時；

―當潔凈室（區）結構或區域分布有重大變動時。

 

附錄A（規范性附錄）潔凈室（區）采樣點布置

A.l潔凈室（區）采樣點布置宜力求均勻，避免采樣點在局部區域過于稀疏。下列多點采樣的采樣點布置圖示可作參考（見圖A.1）。

圖A.1平面采樣點布置圖

 

A.2 100級單向流區域，潔凈工作臺或局部空氣凈化設施的采樣點宜布置在正對氣流方向的工作面上，氣流形式可參考圖A.2、圖A.3。

 

附錄B（規范性附錄）培養基的滅菌及準備

B.1大豆酪蛋白瓊脂培養基（TSA）培養基的滅菌及準備

B.1.1培養基采用大豆酪蛋白瓊脂培養基，可以按以下處方制備，也可使用按該處方生產的符合要求的脫水培養基。配制后按培養基規定的經驗證合格的滅菌程序滅菌。

B.1.2大豆酪蛋白瓊脂培養基配方

酪蛋白胰酶消化物……………………………………………………15g

大豆粉木瓜蛋白酶消化物……………………………………………5g

氯化鈉…………………………………………………………………5g

瓊脂……………………………………………………………………15g

純化水……………………………………………………………1000mL

取上述成分除瓊脂，混合，微熱溶解，調節pH值使滅菌后為7.3±0.2，加入瓊脂，加熱融化后，分裝，滅菌，冷卻至約60℃，在無菌操作要求下傾注約20mL至無菌平皿（φ90mml))中。加蓋后在室溫放至凝固。

 

B.2沙氏瓊脂培養基（SDA）培養基的滅菌及準備

萄萄糖………………………………………………………………40g

酪蛋白胰酶消化物、動物組織的胃酶消化物等量混合…………10g

瓊脂…………………………………………………………………15g

純化水…………………………………………………………1000mL

取上述成分除瓊脂，混合，微熱溶解，調節pH值使滅菌后為5.6±0.2，加入瓊脂，加熱融化后，分裝，滅菌，冷卻至約60℃，在無菌操作要求下傾注約20mL至無菌平皿（φ90mml))中。加蓋后在室溫放至凝固。

 

B.3培養基平皿培養及保存

制備好的培養基平皿宜在2℃~8℃保存，一般以一周為宜或按廠商提供的標準執行。采用適宜方法在平皿上做好培養基的名稱、制備日期記錄的標記。

注1）：如采用其他規格的平皿，可適當增減培養基的量，使之在平皿中形成至少2mm厚的瓊脂層。

 

附錄C（資料性附錄）潔凈室（區）沉降菌技術要求

潔凈室（區）沉降菌技術要求

相近標準：醫藥工業潔凈室（區）懸浮粒子的測試方法(GB_T 16292―2010)全文完整版 http://www.iwuchen.com/a-62/