無菌室標準化規程與驗收規范(含《潔凈室沉降菌測試標準操作規程》)

1.目的

　　本規程旨在為無菌操作及無菌室的保護提供一個標準化規程。

2.適用范圍

　　生測實驗室

3.責任者

　　QC主管生測員

4.定義

　　無

5.安全注意事項

　　嚴格無菌操作，防止微生物污染；操作人員進入無菌室應先關掉紫外燈。

6.規程

　　6.1.無菌室應設有無菌操作間和緩沖間，無菌操作間潔凈度應達到10000級，室內溫度保持在20-24℃，濕度保持在45-60%。超凈臺潔凈度應達到100級。

　　6.2.無菌室應保持清潔，嚴禁堆放雜物，以防污染。

　　6.3.嚴防一切滅菌器材和培養基污染，已污染者應停止使用。

　　6.4.無菌室應備有工作濃度的消毒液，如5％的甲酚溶液，70％的酒精，0.1％的新潔爾滅溶液，等等。

　　6.5.無菌室應定期用適宜的消毒液滅菌清潔，以保證無菌室的潔凈度符合要求。

　　6.6.需要帶入無菌室使用的儀器，器械，平皿等一切物品，均應包扎嚴密，并應經過適宜的方法滅菌。

　　6.7.工作人員進入無菌室前，必須用肥皂或消毒液洗手消毒，然后在緩沖間更換專用工作服，鞋，帽子，口罩和手套(或用70%的乙醇再次擦拭雙手)，方可進入無菌室進行操作。

　　6.8.無菌室使用前必須打開無菌室的紫外燈輻照滅菌30分鐘以上，并且同時打開超凈臺進行吹風。操作完畢，應及時清理無菌室，再用紫外燈輻照滅菌20分鐘。

　　6.9.供試品在檢查前，應保持外包裝完整，不得開啟，以防污染。檢查前，用70％的酒精棉球消毒外表面。

　　6.10.每次操作過程中，均應做陰性對照，以檢查無菌操作的可靠性。

　　6 .11.吸取菌液時，必須用吸耳球吸取，切勿直接用口接觸吸管。

　　6.12.接種針每次使用前后，必須通過火焰灼燒滅菌，待冷卻后，方可接種培養物。

　　6.13.帶有菌液的吸管，試管，培養皿等器皿應浸泡在盛有5%來蘇爾溶液的消毒桶內消毒，24小時后取出沖洗。

　　6.14.如有菌液灑在桌上或地上，應立即用5%石碳酸溶液或3％的來蘇爾傾覆在被污染處至少30分鐘，再做處理。工作衣帽等受到菌液污染時，應立即脫去，高壓蒸汽滅菌后洗滌。

　　6.15.凡帶有活菌的物品，必須經消毒后，才能在水龍頭下沖洗，嚴禁污染下水道。

　　6.16.無菌室應每月檢查菌落數。在超凈工作臺開啟的狀態下，取內徑90mm的無菌培養皿若干，無菌操作分別注入融化并冷卻至約45℃的營養瓊脂培養基約15ml，放至凝固后，倒置于30～35℃培養箱培養48小時，證明無菌后，取平板3～5個，分別放置工作位置的左中右等處，開蓋暴露30分鐘后，倒置于30～35℃培養箱培養48小時，取出檢查。100級潔凈區平板雜菌數平均不得超過1個菌落，10000級潔凈室平均不得超過3個菌落。如超過限度，應對無菌室進行徹底消毒，直至重復檢查合乎要求為止。

7.參照

　　參照《藥品衛生檢驗方法》 《中國藥品檢驗標準操作規范》中(無菌檢查法)章節 中華人民共和國醫藥行業標準YY/T0188.6-1995《藥品檢驗操作規程》

8.分發部門

　　質量管理部

無菌室技術指導說明

　　在獲得了無菌環境和無菌材料后，我們還要保持無菌狀態，才能對某種特定的已知微生物進行研究或利用它們的功能，否則外界的各種微生物很容易混入。外界不相干的微生物混入的現象，在微生物學中我們叫做污染雜菌。防止污染是微生物學工作中十分關鍵的技術。一方面是徹底滅菌，另一方面防止污染，是無菌技術的兩個方面。另外，我們還要防止所研究的微生物，特別是致病微生物或經過基因工程改造了的本來自然界不存在的微生物從我們的實驗容器中逃逸到外界環境中去。為了這些目的，在微生物學中，有許多措施。

　　無菌室內的地面、墻壁必須平整，不易藏污納垢，便于清洗。工作臺的臺面應該處于水平狀態。無菌室和緩沖間都裝有紫外線燈，無菌室的紫外線燈距離工作臺面1米。工作人員進入無菌室應穿滅過菌的服裝，戴帽子。

　　當前無菌室多存在于微生物工廠，一般實驗室則使用超凈臺。超凈臺其主要功能是利用空氣層流裝置排除工作臺面上部包括微生物在內的各種微小塵埃。通過電動裝置使空氣通過高效過濾器具后進入工作臺面，使臺面始終保持在流動無菌空氣控制之下。而且在接近外部的一方有一道高速流動的氣簾防止外部帶菌空氣進入。

　　在條件較困難的地方，也可以用木制無菌箱代替超凈臺。無菌箱結構簡單，便于移動，箱正面開有兩個洞，不操作時用推拉式小門擋住，操作時可以將雙臂伸進去。正面上部裝有玻璃，便于在內部操作，箱內部裝有紫外線燈，從側面小門可以放進去器具和菌種等。

應用

無菌操作技術當前不僅在微生物學研究和應用上起著舉足輕重的作用，而且在許多生物技術中也被廣泛應用。例如轉基因技術、單克隆抗體技術等。

潔凈室沉降菌測試標準操作規程

1目的：建立潔凈室中沉降菌的測試標準操作規程，保證藥品在規定潔凈級別內進行生產。

2范圍：潔凈室的沉降菌的監測。

3依據：國家標準GB/T 16294-1996。

4職責：QA潔凈度監測人員、微生物檢驗人員對本制度的實施負責。

5內容
5.1潔凈室：對塵粒及微生物污染規定需進行環境控制的房間或區域。

5.2潔凈工作臺：一種工作臺或者與之類似的一個封閉圍擋工作區。其特點是自身能夠供給經過過濾的空氣或氣體，如垂直層流潔凈罩、水平層流罩、垂直層流潔凈工作臺、水平層流潔凈工作臺、自凈器等。

5.3潔凈度：潔凈環境內單位體積空氣中含大于或等于某一粒徑懸浮粒子的允許統計數。

5.4菌落：細菌培養后，由一個或幾個細菌繁殖而形成的一細菌集落，簡稱CFU。通常用個數表示。

5.5測試方法
5.5.1方法概述：本測試方法利用沉降法，即通過自然沉降原理收集在空氣中的生物粒子于培養基平皿，經48小時以上培養，在適宜的條件下讓其繁殖到可見的菌落數，來評定潔凈環境內的活微生物數，并以此來評定潔凈室的潔凈度。
5.5.2所用的儀器和設備
5.5.2.1高壓消毒鍋：使用時參照文件GZ-ZL-SOP-066-00進行操作。
5.5.2.2恒溫培養箱：必須定期對培養箱的溫度計進行檢定。
5.5.2.3培養皿：一般采用中90mm×15mm硼硅酸玻璃培養皿。使用前將培養皿置于121℃濕熱滅菌20分鐘。
5.5.2.4培養基：普通營養瓊脂培養基。將培養基加熱熔化，冷卻至約45℃在無菌操作條
件下將培養基注入培養皿，每皿約15m1。待瓊脂培養基凝固后，將培養基平皿放入30～35℃恒溫培養箱中培養數小時，若培養基平皿上確無菌落生長，即可供采樣用，制備好的培養基平皿應在2～8℃的環境中存放。
5.5.3測試步驟
5.5.3.1采樣方法：將已制備好的培養皿放置在預先確定的取樣點，打開培養皿蓋，使培養基表面暴露0.5小時，再將培養皿蓋上蓋后倒置。
5.5.3.2培養：全部采樣結束，將培養皿倒置于恒溫培養箱中培養。在30～35℃培養，時間不少于48小時。每批培養基應有對照試驗，檢查培養基本身是否污染，可每批選定3只培養皿作對照培養。
5.5.3.3菌落計數：用肉眼直接計數，然后用5～10倍放大鏡檢查，有否遺漏。若培養皿上有2個或2個以上菌落重疊，可分辨時仍以2個或2個以上的菌落計數。

5.6注意事項
4.6.1測試用具要做滅菌處理，以確保測試的可靠性、正確性。
5.6.2采取一切措施防止人為對樣本的污染。
5.6.3對培養基、培養條件及其他參數作詳細的記錄。
5.6.4由于細菌種類繁多，差別甚大，計數時一般用透射光于培養皿背面或正面仔細觀察，不要漏計培養皿邊緣生長的菌落，并須注意細菌菌落與培養基沉淀物的區別，必要時用顯微鏡鑒別。
5.6.5采樣前應仔細檢查每個培養皿的質量，如發現變質、破損或污染的應剔除。

5.7測試規則
5.7.1測試狀態
5.7.1.1沉降菌測試前：被測試潔凈室（區）的溫濕度須達到規定的要求，靜壓差、必須控制在規定值內。被測試潔凈室（區）已消毒。
5.7.1.2測試狀態有靜態和動態兩種，并在報告中注明測試狀態。
5.7.1.3測試人員：測試人員必須穿戴符合環境潔凈度級別的工作服。靜態測試時，室內測試人員不得多于2個人。
5.7.2測試時間
5.7.2.1對單向流，如100級凈化房間內及層流工作臺，測試應在凈化空調系統正常運行不少于10分鐘后開始。
5.7.2.2對非單向流，如10000級、100000級以上的凈化房間，測試應在凈化空調系統正常運行不少于30分鐘開始。

5.8沉降菌計數
5.8.1最少采樣點數目：可按表1確定。在滿足最少測點數的同時，還宜滿足最少培養皿數，見表2。
表1最少采樣點數目
面積(m2)           潔凈度級別
            100  10000  100000  300000
＜10        2～3  2      2     2
≥10～＜20  4     2      2     2
≥20～＜40  8     2      2     2
≥40～＜100  16    4      2     2
≥100～＜200  40   10     3     3
注：表中的面積對于單向流潔凈室是指送風面積，對于非單向流潔凈室是指房間面積。
表2最少培養皿數
潔凈度級別 所需Φ90mm培養皿數（以沉降0.5小時計）
  100             14
  10000            2
  100000           2
  300000           2
5.8.2采樣點的布置：工作區測試點位置離地0.8～1.5m左右（略高于工作面）。可在關鍵設備或關鍵工作活動范圍處增加測點，采樣點的布置應力求均勻，避免采樣點在某 局部區域過于集中，某局部區域過于稀疏。
5.8.3記錄：測試報告中應記錄房間溫度、相對濕度、壓差、測試狀態及測試數據。
5.8.4結果計算：用計數方法得出各個培養皿的菌落數。平均菌落數的計算見下式：
m1 m2 …… mn
平均菌落數m=n
式中：m為平均菌落數；m1為1號培養皿菌落數；m2為2號培養皿菌落數；mn為n號培養皿菌落數；n為培養皿總數。
5.8.5結果評定：用平均菌落數判斷潔凈室的空氣中的微生物。
5.8.6潔凈室（區）內的平均菌落數必須低于所選定的評定標準（見表3）。
5.8.7若某潔凈室（區）的平均菌落數超過評定標準，則必須對此區域先行消毒，然后重新測試兩次，測試結果必須合格。
表3 
潔凈級別     100級   10000級   100000級   300000級
標準（平均）  1個/皿  3個/皿    10個/皿    15個/皿